On-line Überwachung von mikrobiellen Verunreinigungen in pharmazeutischen Wassersystemen bietet ein großes Potential zur signifikanten Verbesserung sowohl bezüglich der Kontrolle der Keimbelastung in Wasseranlagen als auch in Bezug auf den nötigen Energieaufwand zum Erhalt der Keimfreiheit.
Wasser als Ressource in der Pharmaproduktion
Wasser ist die wohl essentiellste und sensibelste Ressource in der pharmazeutischen Produktion. Klassische mikrobiologische Methoden (kulturabhängige Methoden) dienen seit jeher zur Kontrolle über den Keimgehalt der Ressource Wasser. Die Ergebnisse dieser Laboranalysen werden in KBE (Koloniebildenden Einheiten) ausgewiesen und besitzen nachweislich und wissentlich einen großen Mangel an Sensitivität, Kontinuität und zeitnahem Informationserhalt; ein zeitlicher Verzug von bis zu einer Woche bis zum Ergebniserhalt liegt in der Natur der Methode. Die darüber hinaus nur stichprobenartig möglichen Probenahmen von sehr kleinen Akquisen an den relevanten Probeentnahmestellen stellen eine weitere Limitierung bezüglich des Informationserhalts über den Keimbelastungszustand im Wasser dar. In Folge dieser mangelnden Prozesskontrolle wird versucht pharmazeutische Wassersysteme durch Erhitzung oder dauerhafte Heißhaltung auf ca. 90°C und durch den Einsatz von Chemie dauerhaft keimfrei, bzw. unter Kontrolle, zu halten.
Die Echtzeitkeimzählung auf der Basis der laserinduzierten Fluoreszenz (LIF) in pharmazeutischen Wasseranlagen bietet hier ein großes Potential zur signifikanten Verbesserung sowohl bezüglich der Kontrolle über den mikrobiellen Zustand der Wassersysteme als auch in Bezug auf den nötigen Energieaufwand zum Erhalt der Keimfreiheit. Durch kontinuierliche Beprobung und somit dem Erhalt von stetigen Online-Daten kann jegliche Entartung (ansteigende Verkeimung, Abrisse von Biofilmen, Filtereffizienz und ‑durchbrüche) des Wasseranlagen-Systems rechtzeitig erkannt und entsprechend sofort zielgerichtet und effizient gegengesteuert werden.
Das Problem mit der Aussagekraft der klassischen mikrobiologischen Methoden
Die derzeitige akzeptierte und hauptsächlich praktizierte Methode um die Qualität des Wassers in Bezug auf Keimgehalt zu überprüfen, ist die klassische wachstumsbasierende Methode. Hierfür werden Entnahmen einzelner Proben an signifikanten Probenahmestellen — den sogenannten point-of-use (POU) – vollzogen. Mit den Ergebnissen nach Inkubation und Auszählung der KBE wird versucht die Kontrolle über ganze Wassersysteme zu erlangen. Durch den enormen Aufwand dieser Praxis sind periodische Überprüfungen ein und desselben POU häufig nur in größeren Intervallen möglich. Ergebnisse erlauben nur retrospektive Bewertungen der Wasserqualität (bis zu einer Woche nach Entnahme der Probe). Eine zeitnahe Risikobewertung — ganz zu schweigen von einer kontinuierlichen Prozesskontrolle- ist so nahezu unmöglich. Aufgrund der wohlbekannten fehlenden Sensitivität der klassischen wachstumsbasierenden Methode sind falsch-negative Ergebnisse zu erwarten; es wächst eben nachweislich nur ein kleiner Anteil der sich im Wasser befindlichen Keime auf den eingesetzten Agar-Komplexnährmedien. Des Weiteren kann das mangelnde Nährstoffangebot in pharmazeutischen Wassersystemen zum extremen Schrumpfen der Keime führen, und auch physikalischer und chemischer Dauerstress ein Heranwachsen zu KBE im Labor verhindern; man spricht hier von den sogenannten VBNC (viable but not culturable). Mögliche falsch-positive Einträge sind auf der anderen Seite durch die vielen händischen Eingriffe von den Probenahmen bis hin zum durchgeführten Ausspateln des Probenaliquots im Labor möglich.
Vorteile durch Verwendung eines Echtzeitkeimzählers auf LIF Basis
Energieeffizienz
- Reduktion von Sanatisierungs Zyklen und Chemieeinsatz
- Reduktion der Temperatur von Heißwassersystemen und/oder Reduktion der Aufheizzyklen.
Laboraufwand
- Verminderte Frequenz der Probenahme und des klassischen mikrobiologischen Laboraufwands durch kontinuierliches Online Monitoring und Optimierung
Produktqualität und Prozesskontrolle
- Verbesserte Reaktionsfähigkeit auf mikrobielle Entartungen
- Echtzeitfreigabe von wässrigen Prozessmedien
- Höheres Prozessverständnis und Prozesskontrolle
Laser induzierte Fluoreszenz (LIF) – physikalische Basis der Methode Echtzeitkeimzählung
Die Echtzeitkeimzählung bedient sich der hochsensitiven, spektroskopischen Methode der Laser induzierten Fluoreszenz (LIF). Durch Einsatz eines Lasers werden Metabolite des Zellstoffwechsels in Keimen zur Fluoreszenz angeregt. Man spricht hier von der Erzeugung intrinsischer Fluoreszenz; im Gegensatz zu verwandten Labormethoden, welche ebenfalls zu den LIF´s gehören, aber der Beigabe und Markierung der Zellen mit Fluorophoren bedürfen um eine Fluoreszenzantwort zu erhalten (Durchflusszytometrie) oder einen Inkubationsschritt erfordern um eine ausreichende Menge an intrinsischer Fluoreszenz zu erhalten (Groth-based auto Fluoreszenz Methoden). Der Einsatz von hochenergetischen Lasern (405nm) zur Anregung macht eine Detektion von geringsten Mengen an intrinsischer Fluoreszenz möglich, ohne vorhergehende Probenvorbereitungen wie Färbungen und Inkubationsschritte. Typische Zellmetabolite die durch LIF eine Anregung erfahren sind Tryptophan, NADH, und Flavine. Die Anregungswellenlänge von 405nm ist zugleich abgestimmt auf die Anregungsspektren dieser Zielmetabolite, wodurch eine hohe Anzahl von nicht biologischem Material von der Anregung ausgeschlossen werden kann. Dennoch gibt es eine Reihe an nicht biologischen Stoffen wie Gummi, Plastiken und Cellulose die ebenfalls in diesem Spektrum fluoreszieren. Diese gilt es durch Diskriminierung mittels Software Algorithmen und geeignetem Detektor Design effizient auszublenden.
Der IMD‑W Echtzeitkeimzähler (OWBA) – das richtige Detektor- und Software-Design
Der IMD‑W Echtzeitkeimzähler für Wasser auf LIF Basis ermöglicht die sofortige Detektion von Keimen (in Echtzeit); man spricht auch von Online Water Bioburden Analyzer (OWBA). Der Einsatz von Verbrauchsmaterialien und die Limitierungen der klassischen mikrobiologischen Methoden, wie zuvor erwähnt, entfallen. Der OWBA nutzt einen Laser bei 405nm Wellenlänge für die Anregung der intrinsischen Fluoreszenz und zur Erzeugung von MIE Streulicht gleichzeitig. Zur Detektion der Signale werden eine Photodiode- zur Bewertung des MIE Streulichtsignals- und zwei Photomultiplier (PMT) bei unterschiedlichen Detektionsbereichen zur Detektion der Fluoreszenzantworten eingesetzt. Über diese drei Signale (Photodiode, PMT‑1, PMT‑2), und deren Auswertung über gesetzte Algorithmen, erfolgt eine sehr effiziente Diskriminierung zwischen inerten Partikeln und Keimen. Über die MIE Streulicht Detektion können Aussagen über die Größe der Partikel/Keime getroffen werden. Systeme die nur einen PMT besitzen können diese effiziente Diskriminierung zwischen Keim und Interferenten (Eliminierung von falsch positiven Befunden) nicht gleichermaßen leisten.
Ein weiterer wichtiger Aspekt in Bezug auf die mikribielle Überwachung ist die Überwachung und Kontrolle von Sterilfiltern in Wassersystemen. Keime in pharmazeutischen Wassersystemen haben oftmals, aufgrund des mangelnden Nährstoffangebots, die Tendenz zu stark zu schrumpfen, womit sie in der Lage wären einen 0,2µm Sterilfilter zu passieren. Daher ist es für die absolute Prozesskontrolle der Wassersysteme und das Monitoring der Leistung von Sterilfiltern essentiell einen OWBA mit entsprechender Sensitivität einzusetzen. Die Detektion von Partikeln und Keimen ab 0,2µm muss möglich sein.
Zusammenfassung
Sowohl die regulatorischen Anforderungen als auch die pharmazeutische Industrie selbst forcieren und anerkennen die Notwendigkeit von besseren Analysesystemen um die Keimbelastung in pharmazeutischen Wassersystemen zu überwachen. LIF basierende Echtzeitkeimzähler für Wasser wie der IMD‑W ermöglichen eine Überwachung der Keimbelastung kontinuierlich und eben in Echtzeit. Über diese stetige online Überwachung können lückenlose, aussagekräftige, historische Datensätze zum „Trending“ und zur exakten Bewertung der Keimbelastung in Wassersystemen herangezogen werden. Die Prozesskontrolle und damit die Reaktionsfähigkeit auf Systementartungen (Überschreitung von Grenzwerten), kann durch die kontinuierliche Echtzeitüberwachung in Wasser extrem gesteigert werden. Hieraus ergeben sich weiterhin ein höheres Maß an Prozessverständnis, eine verbesserte Produktqualität, Risikoreduktion und Einsparpotentiale beim Energieverbrauch.
